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Die N-terminale Region des DENV Proteins NS4A bindet an stark gekrümmte Membranen

Das Dengue-Virus (DENV), der Auslöser des Denguefiebers, verursacht jährlich Millionen Neuerkrankungen sowie Tausende Todesfälle. Das Nicht-Struktur-Protein 4A (NS4A) spielt eine Hauptrolle bei der Bildung einer speziellen Gerüststruktur aus Membranen der Wirtszelle, welche für die Replikation des Virus unabdingbar ist. Zwei Transmembranhelices verankern das reife NS4A in der Membran. Die N-terminalen 48 Aminosäurereste des NS4A befinden sich im Zytoplasma, enthalten zwei amphipathische Helices und könnten NS4A als zweiter Membrananker dienen. NS4A(1-48) bindet selektiv an kleine Liposomen mit stark gekrümmter Oberfläche. Die beiden Punktmutationen L6E;M10E in NS4A, welche die Replikation des DENV verhindern, schränken die Bindung des NS4A(1-48) an kleine Liposomen stark ein.

Wir haben die Struktur der beiden rekombinanten Peptide NS4A(1-48) und NS4A(1-48, L6E;M10E) in SDS Mizellen sowie deren Wechselwirkung mit Liposomen untersucht. Beide Peptide sind in Puffer nicht strukturiert und bilden nach Zugabe von SDS Mizellen zwei amphipathische Helices aus. In Gegenwart von Liposomen zeigt allerdings nur der Wildtyp Helixbildung. Des Weiteren erfordert die Bindung des NS4A(1-48) an Liposomen eine starke Krümmung der Membranoberfläche (hydrodynamischer Radius von ca. 26 nm). Für die Mutante wurde keine Bindung an Liposomen beobachtet. Lösung-NMR Daten legen nahe, dass die N-terminale amphipathische Helix in NS4A(1-48) die primäre Lipidbindestelle ist.

NS4A Floatation Assay

Liposomen-Flotations-Untersuchung: Alexa Fluor 488 markierter Wildtyp (A) oder Mutante des NS4A(1-48) (B), bzw. freier Alexa 488 Farbstoff (C) wurden gemeinsam mit kleinen, beschallten Liposomen in die Schicht mit 35% Sucrose eingebracht. Nur Wildtyp NS4A(1-48) befindet sich nach 14 h Zentrifugation in der obersten Schicht geringer Dichte, welche die Liposomen enthält.

Hung et al. (2014) PLoS One 9:e86482
Hung et al. (2015) Biochim Biophys Acta 1848:1119-26
Hung et al. (2015) Viruses 7:4119-30

Dieses Projekt ist eine laufende Kooperation mit dem Labor von Ella H. Sklan der Tel Aviv Universität und den Arbeitsgruppen Hoffmann und Schwarten.


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